?tid=80转自以上帖子，底下是帖子的内容，我复制下来的，如果以为有点乱，不错掀开上头的衔接阿。Sephadex LH20使精心得谈：1 Sephadex LH20是一种价格较高的填料，使用请千万预防，很贵的哟！（天然，雇主有钱就另当别论拉）2 先讲Sephadex LH20 的旨趣。 Sephadex LH20的分离旨趣主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分拨的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，是以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，临了出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分拨的作用，是以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。3 再讲Sephadex LH20 洗脱溶剂。听我讲完 第2点后，其实就应该明晰Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，缓缓增多甲醇比例，临了用100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，缓缓增多甲醇比例，临了用100％甲醇冲柱。4 接下来讲样品的处理和洗脱溶剂的选拔。如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶化melody marks 肛交，过滤后melody marks 肛交，湿法上样（一定要滤喔！如果把Sephadex LH20 堵啦melody marks 肛交，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很肉痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶化，过滤后，湿法上样。5 分离的手段，临了说说我的使精心得（1） 流速不行太快，切切不行新急，所谓欲速则不达。（2）柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增多将极地面改善分离，所不要抠门填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓齐集上风军力，打击敌东说念主。（3） 馏分一定要接的细，可1／10，或1／20 个保留体积接成一馏分。（4） 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对非常保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。（5）鞣质要素死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质（6）Sephadex LH20 对黄酮类要素的分离恶果极佳，要领很成型，有广泛文件参考。（7）填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用 问：在不同的溶剂中的吸涨进度是不是不同?那进行梯度洗脱会不会有影响.还有是不是样品的溶化是不是要与洗脱的起使浓度疏导?如何细则样品在最好配比的容液中溶呢?还有分到什么进度是用Sephadex LH20比拟好? 解答如下:1 "在不同的溶剂中的吸涨进度是不是不同?那进行梯度洗脱会不会有影响."天然有影响，Sephadex LH20在不同的溶剂中的吸涨进度是不同的(任何填料王人是这么，仅仅Sephadex LH20很澄澈)，一般在丙酮，乙酸乙酯 中削弱很强横，是以一般毋庸丙酮，乙酸乙酯 作溶剂，如果前后使用的两种洗脱溶剂对Sephadex LH20的吸涨进度收支很大，还会产生广泛气泡.以下列举了1g干态的，Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积：water 2.1mlMeOH 1.9mlEtOH 1.8mlCHCl3 1.6mln-BuOH 1.6ml丙酮 0.8ml乙酸乙酯 0.4ml甲苯 0.2ml2 "还有是不是样品的溶化是不是要与洗脱的起使浓度疏导?如何细则样品在最好配比的容液中溶呢?"样品的溶化最好与洗脱的起使浓度疏导，但偶然（其实是多数情况下），王人办不到。对Sephadex LH20上样样品的要求是1 样品一定要溶化（Sephadex LH20很贵，要保护填料，我看植化的同道对好填料看得王人很重，劳动问题，哈哈哈；同期，幸免样品不溶化酿成的脱尾）2 溶化样品的体积尽可能小（色谱分离表面的基本要求，减小原始谱带宽度）3 样品的溶化最好与洗脱的起使浓度疏导（若样品的溶化溶剂比洗脱的起使浓度洗脱才调强，则会东说念主为增多洗脱起使溶剂的洗脱才调；同期若样品的溶化溶剂与洗脱的起使溶剂辞别很大，样品可能以为溶化性的问题而析出。） 以上三点是上样的基本要求，偶然很难求全，只好阐发具体的骨子来决定了。一般我的作念法是得志1，2点，尽量得志第三点，“如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶化”，请预防我的述说“尽可能”，3 "还有分到什么进度是用Sephadex LH20比拟好?"如果实际室Sephadex LH20很脱落，分说念较纯再用， 如果实际室Sephadex LH20很普及，只消得志使用的预防事项，较粗的样品可径直使用Sephadex LH20分离。日本的师兄王人是用Sephadex LH20粗分，东说念主家有钱，是以不在乎。如果硅胶比Sephadex LH20还贵，你一定先用Sephadex LH20粗分，再用硅胶吧。有许多问题根柢不是学术自己的问题，东说念主也不行能在真空中搞科研。哈哈，跑题了。 问：那上样体积与柱体积最小的比是些许？我用100克的填料，如果样品不好溶，那一次最多能上些许毫升的样呢？1 在分离历程中遭受要分离的样品量很大，而柱层填料相对较少的情况是许多的.一般处置的阶梯有两条:1） 将样品一次全上柱，这么分离恶果一定不会好，但咱们的侧略是将样品交叠的部分再上一遍或几遍，这叫反复xxxx柱层，平允是责任量小（对比底下就知说念了），在前后较纯的馏分，如果考虑组重量弥漫，可就乐去吧。2 ） 将样品分几次鉴别分离，这么每次分离的恶果一定比将样品一次全上柱的分离恶果好，但这么有一个很大的弊病，即是每次柱层的条目不行能保合手透顶一至，这么几次柱层分离的馏分间的重现性就存在很大问题，再将几个分开上的柱层馏分合并的历程中，合的太粗，就如同 将样品一次全上柱的合并收尾，仅仅责任量增大了。如果心中不甘，你中有我我中有你的馏分，我也不知怎样合并了。是以推选的作念法是将样品一次全上柱，再通过反复柱层的要领来徐徐擢升分离恶果，唉呀，我嘴苯，不知有莫得说清。2 100g填料已不少了， astra兄的样品如果的确太多，就只好分开上柱了.3 一般Sephadex LH20上样体积具体也莫得明确的律例，在柱床体积的1／10吧。 问：分得恶果不是很好，上了有8毫升的样，我用甲醇洗脱，收尾用约一个保留体积就洗罢了，东西不仅越分越少，并且仍然和没上柱之前差未几，很让东说念主困惑，报怨。不要暴燥，实际是一丝一丝作念出来的，刚运转老是贫乏的.领先我要说的是Sephadex LH20不是全能的，你的样品不一定适于用它分离，1 "收尾用约一个保留体积就洗罢了"，这很平方，这亦然Sephadex LH20这种填料的秉性:"洗脱体积一般为2-3个保留体积，对非常保留强的化合物，可洗脱5个保留体积"，2 "我用甲醇洗脱，并且仍然和没上柱之前差未几"，证明你的样品组分之间分子大小辞别不大，是以Sephadex LH20的凝胶过滤作用不起作用了，如果你还用Sephadex LH20分离，那你应该期骗他反相分拨的作用，即先用低浓度的甲醇/水，缓缓擢升甲醇比例，临了才用甲醇洗脱. 1 A君提到用极少的甲醇/水-甲醇洗脱，但洗出的流份比拟难处理，是指甲醇水难蒸干吗?其实这根柢不应成为问题.astra君请念念一念念，作念植化的，哪有遇不到甲醇水的时辰， ODS柱层用甲醇水洗脱， Sephadex LH20柱层用甲醇水洗脱，D101用酒精水洗脱， HP20 用甲醇水洗脱， 高效液相最常用的是反相， 流动相仍是甲醇水，可见甲醇水是植化同道最亲密的一又友! 是以蒸不干也要蒸，念念念念主见吗!2 .像水这种高沸点的溶剂是很难蒸干的，，主见是有的，先望望旋转薄膜的几个要素: 真空度， 冷凝液， 挥发温度.1) 真空度决定于水泵的效用和系统的密闭性.一般的国产水泵就能得志日常的需要(包括蒸水)，但一定预防的是水泵的轮回水一定要开，如果不开轮回水，水泵中的水很快就会变得很热，将极地面减少水泵的效用，且会将抽出的溶剂挥散出来，很不好! 比国产水泵更好的是入涎水泵，比入涎水泵更好的是隔阂泵，系统的密闭性就更弥留了，超越是蒸像水，丁醇这么的溶剂，对系统的密闭性的要求很高，关于系统密闭性不好时，可继承徐徐拆分法来查漏，最容易出问题的场所在垫圈，国产的旋转薄膜配的垫圈很烂，全不耐氯仿等有机溶剂，当用国产的旋转薄膜蒸过氯仿等有机溶剂，垫圈就废了.是以要多研讨几个垫圈.2) 冷凝液一般使用水，如果配一台冷阱，使用半量的水配比上办量的汽车冷冻液， 恶果棒极了3) 擢升挥发温度天然不错擢升挥发的效用，但可能发生物资的变化，国产旋转薄膜，水泵，用水冷，天然就只好擢升挥发温度了我用东京理化的旋转薄膜，1/2汽车冷冻液冷凝，隔阂泵，蒸水不到45度，很爽!3 向要蒸的水溶液中加甲醇，使甲醇占到30%，蒸出速率将大大擢升! Sephadex LH20柱子被污秽了，大多数情况下是由于样品没滤， 将柱头堵住，或由于样品的死吸附(一般很少发生)，使柱子的柱头部分浑浊，一般的处理是将被浑浊的柱头部分的填料弃去，具体作念法很浅显，只将被浑浊的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起，倒掉即可，2 如果柱子整个这个词被浑浊，如果是将Sephadex LH20用反相被浑浊，主见如下次序用水，NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗涤被浑浊的柱子。因为是整个这个词柱子被浑浊，是以浑浊物一定不会透顶死吸附在柱上（如果透顶死吸附在柱上，浑浊物一定会只在柱头部分），是以用合适的溶剂一定不错将之洗下来。NaOH-NaCl水溶液配法： 8g NaOH ，30g NaCl， 1000ml水 看了上头战友们的商议，嗅觉受益菲浅。小弟也来弄斧班门，发言不合之处，请诸君兄台指正：Sephadex G型葡聚糖凝胶只相宜在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后即是Sephadex LH-20。此君既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂构成的溶剂中还有反相层析恶果。天然价位很高，但由性能颇佳，可再生期骗，是以倍受钦睐。此外上柱样品耗损很少，对处理小样品较好，这亦然咱们实际室常用的原因之一。我用Sephadex LH-20的要领是：1.选拔条目：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么弥留。领先你的样品须要能溶化在尽量极少的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。咱们实际室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了许多年，恶果较好。2.饱和层析柱：用洗脱剂将凝胶摇匀，矗立柱身，让其天然千里降，此时要正式气泡留在其中。至少半小时掀开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，主见是使其扩张在正确比例的洗脱剂中。3.样品处理：用尽量少的洗脱剂溶化样品，常压过滤。4.湿法上柱。这亦然要有手段的要领。5.洗脱：竣事流速，一般1drop/s以下，可参见厂家的一些参数;必要时变嫌极性（许多时一个极性就不错将样品洗脱完毕）。6.再生以备下次使用。 问：不知说念用反响柱分聚散用LH-20阿谁恶果比拟好.同期如果用并吞根LH-20的话，洗脱剂不错从氯仿-甲醇换到甲醇-水吗?还有一个问题，上LH-20的时辰不错用一个梯度洗脱吧?临了用甲醇冲柱就不错了吧??1.Sephadex LH-20主要仍是分子筛的作用机理，在非极性溶剂中有一定的反相柱恶果。如要分离的物资在反相板上分离恶果好，那么大可在反相柱中进行分离;如果要分离的物资分子量收支较大，天然是Sephadex LH-20恶果好。骨子使用中常常上在沿途互助使用，缓缓细分为多个部分直到拿到纯品。2.Sephadex使用时一般不进行梯度洗脱（洗柱的时辰天然要换）。如果改变流动相的极性，会改变凝胶的扩张率，重量不同的物资在网孔改变历程中引起交错，反而够不上分离恶果。如果要分离的样品中极性收支较大，不错细分为不同的极性段再上Sephadex LH-20 咱们实际室用的LH-20柱一般即是甲醇：二氯甲烷（1：1）作流动相，如果冲不干净就换纯甲醇来冲，没碰到过你说的情况！阐发LH-20在不同溶剂中的溶涨进度不同，如果你用的溶剂溶涨整个接近的话，可能影响不大，如果溶剂之间溶涨整个收支较大，我念念出现气泡是可能的。（借用前边同学提供的数据）以下列举了1g干态的，Sephadex LH20对不同溶剂中的保留体积：water 2.1mlMeOH 1.9mlEtOH 1.8mlCHCl3 1.6mln-BuOH 1.6ml乙酸乙酯 0.4ml甲苯 0.2ml丙酮 0.8ml好东西.顶一下......相配感谢楼主!不良少妇